Среды для выращивания анаэробных микробов. Мясопептонный печеночный бульон Кита - Тароцци (МППБ). Свежую или замороженную пе­чень (лучше крупного рогатого скота) режут на мелкие куски, заливают равным по массе количеством водопроводной воды, варят в течение часа, фильтруют через ва­ту и добавляют к 1 части полученного экстракта 3 части мясопептонного бульона. Смесь нагревают до кипения, добавляют химически чистую поваренную соль (на 1 л среды 1,25 г) и доводят рН до 7,6-7,8, после чего кипя­тят в течение 15 мин и фильтруют через бумажный или увлажненный ватный фильтр. К профильтрованному бульону добавляют мелко нарезанные кусочки (по 1,5- 2 г) печени, из расчета на 1 л бульона 100 г печени (печень предварительно очищают от пленок и промыва­ют водой). В пробирку помещают несколько таких ку­сочков, наливают высоким столбиком 7-10 мл бульона, на поверхность его наслаивают вазелиновое или парафи­новое масло.

Бульон с кусочками печени стерилизуют под избы­точным давлением 0,1 МПа в течение 30 мин. С целью удаления из пробирки кислорода перед посевом среду кипятят 10 мин и быстро охлаждают водой.

Полужидкий агар для анаэробов . К МПБ добавляют 0,25-0,75% агар-агара и 1% глюкозы; рН среды 7,4. Среду разливают высокими столбиками в про­бирки. Стерилизуют дробно текучим паром по 15-20 мин в течение 3 дней.

Среды для выращивания молочнокислых бактерий. Молоко (цельное). Нагревают до кипения. Наливают в тубусную склянку и ставят на 10-20 ч в холодное место для отстаивания сливок. По истечении этого вре­мени через кран тубуса разливают обезжиренную часть молока по пробиркам, закрывают ватными пробками. Стерилизуют дробно при 100° С три дня по 20 мин или при 112° С однократно 30 мин.

Обезжиренное молоко . Для получения обез­жиренного молока цельное молоко сепарируют и далее поступают так же, как при использовании цельногомолока.

Гидролизованное молоко (по Богданову). Берут 1 л прокипяченногои остуженного до 45° С обезжиренного молока, устанавливают рН 7,6-7,8, добавляют 0,5 г порошка панкреатина (разведенного предвари­тельно в небольшом количестве теплой воды) или 2-3 г измельченной поджелудочной железы и через несколько минут 5 мл хлороформа. После этого бутыль тщательно встряхивают, плотно закрывают корковой пробкой и по­мещают на 3 суток в термостат при температуре 40° С при ежедневном встряхивании жидкости. По истечении указанного срока с целью удаления хлороформа бутыль открывают, жидкость фильтруют и разбавляют в 2-3 раза водопроводной водой. Доводят рН среды до 7,0- 7,2 и стерилизуют.

Агар из гидролизованного м о л о к а. К гидролизованному молоку прибавляют 1,5-2% агара, рас­плавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют под избыточным давлением 0,1 МПав течение 15 мин. На этой среде хорошо растут молочнокислые палочки.

Сывороточный агар . На 100 мл водопроводной воды берут 7,5 г агара, кипятят до полного растворения, добавляют воды до первоначального объема (т. е. в объе­ме, равном объему испарившейся воды), прибавляют 400 мл заранее приготовленной молочной сыворотки, подвергают действию текучего пара в течение 30 мин, фильтруют через слой ваты, разливают по пробирками стерилизуют под давлением 0,05 МПа в течение 30 мин.

Капустная среда . 200 г измельченной капусты (или люцерны) заливают 100 мл воды и кипятят в кастрюле 10 мин, отжимают через двойной слой марли. Полученную жидкость фильтруют и разводят в 2 раза водопроводной водой. Добавляют 2% глюкозы и 1% пептона, разливают по пробиркам и стерилизуют три избыточ­ном давлении 0,05 МПа в течение 15 мин.

Среда для выращивания осмофильных дрожжей . Примерно в 1 л дистиллированной воды вносят 200 г предварительно подогретого меда, 1 г двуфосфорнокислого калия, 0,5 г сульфата магния, 0,5 г виннокислого аммония, 0,1 г хлористого натрия и 0,1 г хлористого ка­лия. Все компоненты смешивают и стерилизуют под из­быточным давлением 0,1 МПа в течение 20 мин.

Среда для выращивания галофилов . Используют обычные мясопептонные среды с добавлением от 10-15 до 20-30% поваренной соли. Кроме того, при изготовле­нии плотных питательных сред увеличивают и процент­ное содержание агара. Стерилизацию проводят под из­быточным давлением 0,1 МПа в течение 20 мин.

Среды обогащения . Среда Мюллера. К 4,5 г химически чистого мела, предварительно простерилизованного сухим жаром, добавляют 90 мл МПБ и стери­лизуют под избыточным давлением 0,1 МПа в течение-20 мин. Готовят: а) раствор гипосульфита (50 г чистого кристаллического гипосульфита заливают до 100 мл дистиллированной водой, стерилизуют текучим паром в течение 30 мин); б) раствор йода (20 г металлического йода и 25 г йодистого калия заливают до 100 мл дистил­лированной водой). Перед посевом к бульону с мелом стерильно добавляют 10 мл раствора гипосульфита и 2 мл раствора йода. При добавлении каждого ингредиента смесь взбалтывают. Разливают по стерильным пробиркам или колбам.

Среда Киллиана . К 100 мл обычного МПБ стерильно добавляют перед использованием 1 мл водного раствора (1:1000) бриллиантового зеленого.

Классификация питательных сред:

Натуральные – состоят из продуктов животного или растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав. Например: овощные и фруктовые соки, животные ткани, кровь, молоко, яйца и т.д. (МПА, МПБ).

Полусинтетические – в состав входят соединения известной химической природы и вещества неопределенного состава. Например: МПБ с глюкозой, среда Эндо, среда Сабуро.

Синтетические – содержат только химически чистые соединения в точных концентрациях. Применяют в лабораторных экспериментах. Например: среда Чапека, Омелянского, Ушинского и т.д.

Назначение питательных сред

Универсальные (общего назначения)- пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и применяются как основа для специальных питательных сред. Примеры: МПБ, МПА, среда Хоттингера, ГРМ, тиогликолевая среда.

Специальные применяют в тех случаях, когда микроорганизмы не растут на простых средах. К ним принадлежит кровяной, сывороточный агар, сывороточный бульон, асцитический бульон, асцит-агар и другие.

1. Элективные среды - на них одни микроорганизмы растут быстрее и более интенсивно, чем другие виды бактерий. Например, 1 % щелочная пептонная вода является элективной средой для холерных вибрионов, среды Ру и Леффлера – для возбудителей дифтерии.

2. Селективные - благодаря селективным добавкам (желчь, краски, антибиотики и др.) способны подавлять развитие одних видов микроорганизмов, но не влияют на другие виды. Примеры: среда Мюллера является селективной для тифо-паратифозных бактерий, фуразолидоно-твиновий агар – для коринебактерий и микрококков. Добавление антибиотиков в состав сред делает их селективными для грибов (напр. среда Сабуро и др.).

3. Дифференциально-диагностические - группа сред, которые позволяют определить биохимические свойства микроорганизмов и провести их дифференциацию. Они разделяются на среды для определения протеолитических, пептолитических, сахаролитических, гемолитических, липолитических, редуцирующих свойств (среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса).

4. Консервирующие (траспортные)-

предназначены для сохранения жизнеспособности микроорганизмов от момента взятия

биоматериала до посева для диагностики

Жидкие (бульоны) – изучение физиолого-биохимических особенностей и накопление биомассы микроорганизмов

Полужидкие (1% агара) – хранение культур и культивирование анаэробов

Плотные (3-5% агара)– выделение чистых культур, накопление, количественный учет, изучение культуральных свойств, антагонистические взаимоотношения

Сыпучие – хранение посевного материала в промышленности (пшено, отруби)

Сухие – выпускаются промышленностью для приготовления питательных сред

Транспортная система со средой Стюарта

Среда Стюарта представляет собой полужидкий, бедный питательными веществами субстрат для сохранения и транспортировки широкого спектра патогенных микроорганизмов, таких, как Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphteriae, Trichomonas vaginalis, Streptococcus sp., Salmonella sp., Shigella sp. и др. Наиболее требовательные микроорганизмы сохраняются в данной среде более суток, прочие – до нескольких дней.

Наличие в среде тиогликолата подавляет ферментативную активность бактерий, а отсутствие азота предотвращает их размножение.

Транспортная система со средой Кери Блэйр

Транспортная среда Кери Блейр представляет собой модификацию базовой транспортной среды Стюарта, предназначенную специально для фекальных образцов.

Глицерофосфат, являющийся метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, и др.), заменен неорганическим фосфатом,

удален метиленовый синий и рН среды увеличена до 8,4.

Среда Кери Блейр позволяет сохранять большинство патогенов, включая требовательные микроорганизмы, такие как Neisseria sp., Haemophilus sp., Streptococcus sp .

Данная среда является стандартной для транспортировки анаэробов.

Транспортная система со средой Эймса

Транспортная среда Эймса представляет собой очередную модификацию базовой транспортной среды Стюарта, в которой глицерофосфат заменен неорганическим фосфатом, поскольку глицерофосфат является метаболитом некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, ets .) и может поддерживать рост некоторых грамотрицательных микроорганизмов.

Метиленовый синий заменен на активированный уголь фармацевтического качества.

В среду добавлены кальций и магний для поддержания проницаемости бактериальных клеток.

Эта среда способна более 3 дней поддерживать такие микроорганизмы, как Neisseria sp., Haemophilus sp., Corynebacteria, Streptococci, Enterobacteriaceae и др., однако наилучшие результаты дает культивирование в течение первых 24 часов.

Универсальные накопительные среды: Мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон (МПБ)

Являются основными средами для посевов микроорганизмов, для проверки чистоты культур перед биохимическим и серотипированием.

Их используют для культивирования и подсчета неприхотливых микроорганизмов. В полужидком виде среда может быть использована для хранения контрольных (эталонных) микроорганизмов.

Универсальные накопительные среды Среда Хоттингера

Предназначен для культивирования различных микроорганизмов, таких как энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки, некоторые виды стрептококков. При необходимости может быть обогащен углеводами, солями.

Содержит гидролизат Хоттингера, который получают путём ферментативного гидролиза мясного фарша (говяжьего) панкреатином с последующим фильтрованием и добавлением хлороформа в качестве консерванта.

Универсальные накопительные среды: Среда Мюллера-Хинтона

Эту среду используют для культивирования Neisseria sp. и для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным средствам.

Среда МакКонки

Среды МакКонки в качестве дифференциальных рекомендуют для селективного выделения энтеробактерий и близких к ним грамотрицательных палочек.

Лактозоположительные штаммы растут с образованием розовых или красных колоний, которые могут быть окружены зоной преципитации желчных солей.

Красный цвет появляется в результате закисления среды продуктами разложения лактозы (при падении рН ниже 6,8) и адсорбции нейтрального красного.

Штаммы, не ферментирующие лактозу (шигеллы, сальмонеллы), обычно образуют прозрачные бесцветные колонии и не изменяют среду.

Дифференциально-диагностические среды: Среда Эндо

Эта среда разработана Endo как культуральная среда для дифференциации микроорганизмов, ферментирующих и неферментирующих лактозу. Она используется для микробиологического исследования воды, стоков, молочных и других пищевых продуктов.

Сульфит натрия и основной фуксин обладают подавляющим эффектом на грамположительные микроорганизмы. Лактоза разлагается микроорганизмами до альдегида и кислоты. Альдегид в свою очередь освобождает фуксин из фуксин-сульфитного комплекса, усиливая красное окрашивание колоний. У кишечных палочек эта реакция очень выражена и сопровождается кристаллизацией фуксина, что проявляется зеленоватым металлическим блеском (фуксиновый глянец) колоний.

Дифференциально-диагностические среды: Желточно-солевой агар

Эту среду используют в качестве селективной для выделения клинически значимых культур стафилококков.

Маннит является ферментируемым и дифференцирующим субстратом, а также источником углерода.

Добавление (до 5% об/об) эмульсии яичного желтка дает возможность определить липазную активность микроорганизмов. Эмульсия в солевой среде становится прозрачной, поэтому при наличии липазной активности вокруг колоний формируется желтая непрозрачная зона.

Дифференциально-диагностические среды: Вильсона-Блера или Висмут-сульфитный агар

Селективная среда для выделения сальмонелл.

Пептический перевар животной ткани и мясной экстракт служат источником азотистых питательных веществ, углерода, серы, витаминов группы В и микроэлементов, необходимых для роста указанных бактерий.

Бриллиантовый зеленый подавляет рост всех грамположительных бактерий. Глюкоза является ферментируемым углеводом. Сульфат железа позволяет выявить продукцию сероводорода.

Висмут является тяжелым металлом, который подавляет рост большинства грамотрицательных кишечных бактерий, кроме сальмонелл.

Сальмонеллы восстанавливают сульфат железа в присутствии глюкозы и сульфита висмута до сульфида железа, который окрашивает их колонии в черный цвет.

Специальные элективные среды: Среда Леффлера

Эту среду с добавлением лошадиной сыворотки используют для культивирования Corynebacterium diphtheriae из клинического материала и пересевов чистых культур этих микроорганизмов.

Высокая концентрация сыворотки помогает определить протеолитическую активность микроорганизмов, а также пигментообразование. Пептон и мясной экстракт обеспечивают микроорганизмы важнейшими питательными веществами. Глюкоза является ферментируемым субстратом и источником энергии.

Специальные селективные среды: Кампилобакагар

Селективная среду для кампилобактерий которая состояла из основы кровяного агара с бараньей кровью или лошадиной кровью и антибиотиками.

Антимикробные компоненты, существенно подавляют рост нормальной микрофлоры, способствуя росту и выделению из испражнений Campylobacter fetus ssp. jejuni .

Присутствие амфотерицина В в добавке существенно или полностью подавляет рост грибов, введенный позже цефалотин усиливает подавление нормальной кишечной микрофлоры.

Колонии Campylobacter fetus ssp. jejuni имеют слизистый характер, плоские серые с неправильными очертаниями или приподнятые, округлые, без гемолиза.

Некоторые штаммы могут образовывать желто-коричневые или розоватые колонии.

На влажной поверхности среды может наблюдаться слияние роста или роение

Питательные среды - биологические препараты, используемые для выращивания микроорганизмов и изучения культуральных, биохимических, антигенных свойств, фаголизабельности и чувствительности к антибиотикам.

Питательные среды широко используют в лабораторной практике при диагностике инфекционных заболеваний, а также для контроля за стерильностью лекарственных средств. Для того чтобы микроорганизмы росли и развивались, питательные среды должны отвечать следующим требованиям.

1. Оптимальный состав. В их состав должны входить все необходимые компоненты, которые нужны для развития микробов: белки, витамины, углеводы, минеральные вещества.

2. Оптимальное значение pH. Большинство микроорганизмов развивается при pH 7,2…7,4.

3. Стерильность. Она необходима для того, чтобы избегать конкурентной борьбы между микробами.

4. Прозрачность. Для лучшего изучения характера микробных колоний.

5. Влажность. Питание и дыхание осуществляются путем осмоса и диффузии, поэтому питательные среды должны быть слегка влажными.

Классификация сред . Питательные среды подразделяют по следующим признакам.

1. По консистенции: а) плотные (твердые) - агара 1,2…2 % (мясопептонный агар); б) полужидкие - агара 0,2…0,3 % (полужидкий агар); в) жидкие - мясопептонный бульон.

Для придания средам плотной или полужидкой консистенции чаще всего используют агар-агар - полисахарид, выделяемый из морских водорослей. Агар способен образовывать в воде гель, плавящийся при 80…100 °С и затвердевающий при 37…40 °С. Устойчивость агара к разжижающему действию большинства микроорганизмов, а также способность образовывать прочные студни обусловили его широкое применение в бактериологии.

2. По происхождению: а) искусственные: животного (МПА, МПБ) и растительного происхождения (пивное сусло); б) естественные: животного (кровь, молоко) и растительного происхождения (кусочки картофеля).

3. По составу: а) белковые; б) безбелковые; в) минеральные.

4. По назначению: а) среды для культивирования (простые, специальные); б) среды для обогащения (для накопления микроорганизмов при их низкой концентрации в исходном материале); в) среды консервирующие для первичного посева и транспортировки патогенов; г) среды для идентификации (дифференциально-диагностические) - микробы одного вида образуют колонии, отличающиеся по внешнему виду от колоний других микроорганизмов.

Если материал слабо загрязнен посторонней микрофлорой, то для выделения культур применяют простые среды общего назначения (МПА), при обильной контаминации сапрофитами используют специальные среды: элективные (для отдельных видов) и дифференциально-диагностические (для облегчения идентификации).

Характеристики сред . Консервирующие транспортные среды (глицериновая смесь, фосфатный буфер, тиогликолевая среда для анаэробов и др.). Предупреждают отмирание патогенных микробов и подавляют рост сапрофитов.

Среды обогащения (селективный бульон, желчный бульон, среда Мюллера, Раппопорт, среда Кауфмана, щелочная пептонная вода). Применяют для накопления определенной группы бактерий за счет создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто используют различные красители и химические вещества - соли, желчные кислоты, теллурит калия, антибиотики, фуксин и т. д.

Элективные (селективные среды) . Обеспечивают более благоприятные условия для изолируемого микроба с одновременным подавлением сопутствующей микрофлоры. Например, среды Плоскирева и солевой агар применяют для первичного посева материала или для пересева с консервирующих сред или сред обогащения с целью получения чистой культуры.

Дифференциально-диагностические среды . Предназначены для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ.

Среды для выявления протеолитической, гемолитической способности микробов . Содержат в своем составе белковые вещества (кровь, молоко, желатин и др.).

Среды с индифферентными химическими веществами . Служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими видами (цитратный агар Симмонса).

Среды с углеводами (моносахариды, дисахариды, полисахариды), многоатомными спиртами (сорбит, маннит), гликозидами (салицин, инозит) для обнаружения соответствующих ферментов.

Среды для определения редуцирующей способности микробов . В своем составе содержат краски, обесцвечивающиеся при восстановлении (агар Омелянского с индигокармином), а также нитраты для определения денитрифицирующей способности микроорганизмов.

Сухие питательные среды . В бактериологических лабораториях используют в основном коммерческие сухие среды. Они представляют собой высушенные и измельченные до порошкообразного состояния готовые питательные среды. У сухих сред имеется ряд преимуществ перед средами обычного изготовления: их можно хранить длительно в сухом затемненном помещении в герметически закрытой таре, они транспортабельны, удобны в применении и стандартны, что облегчает получение сравнимых результатов при бактериологическом исследовании.

Плотные среды состоят из питательной основы, агар-агара, индикаторов и других органических и минеральных веществ, улучшающих рост одних и задерживающих рост других микроорганизмов.

В качестве питательной основы сухих сред используют различные источники белка. За рубежом сухие среды чаще всего изготавливают на мясопептонном бульоне, требующем большого расхода говяжьего мяса. В нашей стране в качестве источника белка используют гидролизаты кильки, казеина, кормовых дрожжей.

Для упаковки сухих питательных сред используют стеклянные банки из оранжевого стекла (250 г), полиэтиленовые банки (250, 500, 1000 г), а также пакеты из трехслойной ламинированной бумаги (50…200 г). Сроки хранения в стеклянных и полиэтиленовых банках составляют 2…4 года, а в пакетах из трехслойного ламината - от 1 года до 4 лет.

Отечественная промышленность выпускает более 120 наименований различных сухих питательных сред. Крупнейшими производителями являются ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) и ГНЦПМ (г. Оболенск) (Меджидов М. М. Справочник по микробиологическим питательным средам. - М.: Медицина, 2003). Наиболее часто применяют в практических лабораториях следующие среды.

Сухие дифференциально-диагностические среды . Если раньше в практике ветеринарных бактериологических лабораторий для идентификации микроорганизмов широко использовались среды Гисса, содержащие какой-либо одни углевод, то в последнее время все шире стали применяться среды, позволяющие дифференцировать микроорганизмы по двум-трем признакам.

Среда Росселя (ФГУП НПО «Питательные среды»). Предназначена для первичной идентификации энтеробактерий. Готовая среда имеет зеленый цвет. После посева культуры через 18…20 ч инкубации при 37 °С о ферментации лактозы судят по появлению желтой окраски в скошенной части агара, а о ферментации глюкозы - по желтой окраске столбика агара. О газообразовании заключают по появлению пузырьков, разрывам агара. Если микроорганизм не ферментирует глюкозу и лактозу, то среда остается зеленой или приобретает синий цвет.

Среда Клиглера (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала и АООТ «Биомед» им. И. И. Мечникова, г. Москва). Предназначена для первичной идентификации энтеробактерий. Готовая среда имеет красный цвет. Скашивать необходимо так, чтобы остался столбик высотой 2.5…3 см. Посев производят сначала в толщу среды, а затем по скошенной поверхности. Через 18…20 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты. Если микроорганизм ферментирует лактозу, то скошенная часть агара приобретает желтый цвет. При сбраживании глюкозы среда желтеет в столбике. При газообразовании - появление пузырьков и разрывы агара. В случае образования сероводорода среда приобретает черный цвет. Продуцирование индола определяют при помощи специальных индикаторных бумажек.

Двухслойный железоглюкозолактозный агар с мочевиной . Среда Олькеницкого (ФГУП НПО «Питательные среды»). Эти среды позволяют идентифицировать бактерии по их способности ферментировать глюкозу и лактозу, образовывать сероводород и расщеплять мочевину. С подробной инструкцией о приготовлении, способе посева микроорганизмов и учете результатов можно ознакомиться в «Справочнике по микробиологическим питательным средам» М. М. Меджидова.

Сухие элективные питательные среды . Элективный солевой агар (СА) (ФГУП НПО «Питательные среды» и ФГУП «Аллерген», г. Ставрополь). Предназначен для выделения стафилококков из исследуемого материала. Может служить основой для приготовления желточно-солевого или молочно-солевого агара. При посеве материала на СА через 48 ч инкубации при 37 °С рост стафилококков в виде круглых колоний диаметром 2…4 мм.

Элективно-питательная среда для выделения пневмококка (пневмококк-агар) (ФГУП НПО «Питательные среды»). Предназначена для элективного выделения пневмококка из патологического материала (крови, мокроты, гноя). Готовая среда имеет коричневый цвет. Через 24…48 ч после посева материала и инкубации его при 36…38 °С в условиях «свечного сосуда» пневмококк образует на среде выпуклые колонии размером до 1 мм, хорошо отличимые от бледно-розовых колоний стафилококка.

Питательная среда для изоляции грибов рода Candida (кандида-агар) (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала). Предназначена для выделения грибов рода Candida из инфицированного материала и объектов внешней среды. Среда не подлежит автоклавированию. Грибы рода Candida на этой среде через 22…24 ч инкубации при 37 °С образуют плотные выпуклые или плоские колонии сметанообразной консистенции с ровными или волнистыми краями размером 1…2 мм.

Среда подавляет рост сопутствующей бактериальной флоры (кишечной палочки, протея, стафилококка).

Селективный агар для выделения и предварительной идентификации энтеробактерий в моче (аналог агара Мак-Конки) (ФГУП НПО «Питательные среды»). Рекомендуется для выделения и предварительной идентификации энтеробактерий из мочи, а также может быть использован при бактериологическом исследовании пищевых продуктов, фекалий, сточных вод.

Готовая среда красно-коричневого цвета, прозрачная, с легкой опалесценцией. Через 16…20 ч инкубации посева при 37 °С лактозоотрицательные сальмонеллы образуют прозрачные бесцветные колонии, лактозоположительные эшерихии - колонии ярко-малинового цвета. Среда подавляет «роение» протеев, которые растут в виде бесцветных изолированных колоний в О-форме. Рост стафилококков полностью подавляется.

Питательные среды других групп . Гликолевая среда (ФГУП НПО «Питательные среды», г. Махачкала; ОАО «Биомед» им. И. И. Мечникова, г. Москва). Предназначена для контроля стерильности медицинских и биологических препаратов. Учет результатов проводят согласно инструкции «Испытание лекарственных средств на микробиологическую чистоту».

Питательные среды № 1 и 2 выпускают ФГУП НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) и ФГУП «Аллерген» (г. Ставрополь).

Питательная среда для контроля микробной загрязненности сухая № 1 . Используют для определения общей обсемененности нестерильных лекарственных препаратов и пищевых продуктов.

Питательная среда для контроля микробной загрязненности (Сабуро-агар) № 2 . Рекомендуется для культивирования грибов, а также определения содержания грибов в нестерильных лекарственных средах и других объектах внешней среды.

Эритрит-агар и эритрит-бульон . Предназначен для выделения и культивирования бруцелл.

Питательная среда для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба .

Кетоглутаровый агар . Эффективен для изоляции и культивирования возбудителя туляремии.

Среда АГВ . Предложена для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам дискодиффузным методом.

Питательная среда для экспресс-определения антибиотикочувствительности условно-патогенных бактерий . Предложена для ускоренного определения антибиотикочувствительности грамотрицательных условно-патогенных микроорганизмов. Учет результатов можно проводить через 4…5 ч.

Ассортимент выпускаемых отечественной промышленностью сухих питательных сред постоянно расширяется. Приведено лишь небольшое количество тех, которые могут быть использованы в повседневной работе ветеринарных лабораторий. Кроме того, в настоящее время имеется возможность приобретать и импортные питательные среды. Коммерческие названия можно узнать, заказав соответствующие каталоги. Однако их внедрение и широкое использование в ветеринарных лабораториях РФ возможно лишь в отдаленной перспективе из-за довольно высокой стоимости. Кроме того, в этой главе не упомянуты готовые коммерческие питательные среды довольно хорошего качества производства НИЦФ (г. Санкт-Петербург). Они расфасованы во флаконы по 400 мл; срок хранения 1 год. Среды, безусловно, могут быть полезны при проведении бактериологических работ в полевых условиях.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

Эти методы применяются для определения микроорганизмов, которые содержатся в пищевых продуктах в незначительных количествах. Для количественного учета таких микробов вначале следует накопить их на элективных жидких или плотных питательных средах, а затем идентифицировать на плотных дифференциально-диагностических питательных средах. Поэтому определение таких микроорганизмов проводят в два этапа. На первом этапе выясняют, содержатся ли эти микроорганизмы в определенном количестве продукта, в котором их быть не должно согласно санитарным нормам. При обнаружении микроорганизмов производят их идентификацию.

Определение бактерий группы кишечной палочки. На первом этапе делают посевы нужного количества продукта в пробирки со средой Кесслер, которая является накопительной для БГКП. Термостатирование посевов осуществляют при температуре 37 о С в течение 18-20 часов. БГКП сбраживают лактозу, которая входит в состав среды Кесслер, с образованием кислоты и газа. Газ скапливается в поплавках и свидетельствует о наличии БГКП в данном количестве продукта.

На втором этапе материал из пробирок с газом пересевают петлей в чашки с дифференциально-диагностической средой Эндо (посев делают штрихом). Посевы инкубируют при температуре 37 о С в течение 24-х часов. БГКП на среде Эндо образуют колонии или налет красного цвета с характерным металлическим блеском. Из типичных колоний готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Если в мазках выявляют мелкие бесспоровые грамотрицательные палочки, то делают вывод о фекальном загрязнении продукта.

Определение сальмонелл. Для обнаружения сальмонелл на анализ берут достаточно большое количество продукта (25, 50 г). Продукт измельчают в ступке со стерильным песком и вносят в колбы со 100 мл жидкой накопительной среды: Кауфмана, хлористомагниевой «М» или селенитовой. Посевы культивируют при температуре 37 о С в течение 18-20 часов. При наличии помутнения среды делают пересев на среду Эндо, растирая материал шпателем на поверхности среды. Посевы инкубируют при температуре 37 о С в течение 24-х часов. Сальмонеллы на среде Эндо образуют бесцветные или сероватые колонии.

Определение анаэробных сульфитредуцирующих клостридий. Данный анализ ведут в два этапа. На первом этапе производят накопление указанных микроорганизмов на элективной среде Китт-Тароцци. Делают посев 1 мл из 2-го разведения (доза продукта - 0,01 г) в нижнюю часть пробирки со средой и помещают в термостат с температурой 37 о С на 24-48 часов. Признаком роста является помутнение среды, образование осадка, пены. Если обнаружен рост, то затем производят идентификацию выделенных бактерий. В данном количестве продукта хорошего качества анаэробных клостридий быть не должно.

Определение бактерий рода протея. Палочки протея определяют методом Шукевича, основанном на их высокой подвижности. В коденсационную воду свежескошенного мясо-пептонного агара вносят 1-2 капли взвеси из первого разведения продукта, не касаясь поверхности агара. Пробирки с посевами термостатируют при температуре 37 о С в течение 24-х часов. Палочки протея быстрее других вползают на поверхность агара, образуя нежный голубоватый вуалеобразный налет. При микроскопии препарата из верхней части налета обнаруживаются бесспоровые грамотрицательные палочки. Для выделения чистой культуры с целью дальнейшего исследования производят пересев бактерий из верхней части налета в пробирку со скошенным МПА.

2.ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

1. Изучить микробиологические показатели исследуемого продукта и составить схему проведения анализа.

2. Взвесить пробы продукта, растереть в ступках со стерильным песком и приготовить нужное количество разведений.

3. Сделать посевы для определения нормируемых микробиологических показателей.

Цель работы : определение микробиологических показателей исследуемого продукта и оценка его качества. Изучение свойств выделенных микроорганизмов и идентификация их.

1. КРАТКИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Изучение посевов и оценка качества продукта . В чашках с посевами производится подсчет выросших колоний. Подсчет ведут со стороны дна чашек в проходящем свете, отмечая каждую колонию карандашом, причем каждая отдельная колония принимается за одну клетку. Полученные цифры умножаются на показатели разведения продукта, и таким образом получается количество микроорганизмов в 1 г (КМАФАнМ), которое сравнивается с нормативами.

Рост бактерий группы кишечной палочки на среде Кесслер характеризуется появлением газа в поплавках. Это связано с тем, что БГКП сбраживают лактозу с образованием кислоты и газа.

В чашках с молочно-солевым агаром следует обратить внимание на наличие колоний круглой формы золотистого или белого цвета с гладкой блестящей поверхностью, с зонами просветления вокруг, характерных для стафилококков. В посевах для определения сальмонелл и анаэробных клостридий признаком роста является помутнение среды, на что следует обратить внимание.

Необходимо проанализировать результаты посевов и оценить качество исследуемого продукта по соответствию полученных результатов нормативным микробиологическим показателям.

Изучение качественного состава микрофлоры продукта . В чашках с посевами, содержащими изолированные колонии микроорганизмов, следует определить их видовую принадлежность. Для этого необходимо изучить морфологические, культуральные, ферментативные свойства выделенных микробов.

Выделенные колонии рассматривают на свету с помощью лупы и описывают по следующим признакам:

Форма колоний (круглая, эллипсоидная, неправильная и т.д.);

Размер колоний (крупные - более 5-ти мм; средние - 3-5 мм; мелкие - 1-3 мм; точечные - менее 1-го мм);

Цвет колоний; у бактерий, не образующих пигменты, колонии имеют серовато-матовый оттенок;

Рельеф колоний (выпуклые, плоские, стелющиеся и др.);

Характер края (ровный, волнистый, бахромчатый и др.);

Характер поверхности (гладкая, блестящая, матовая, тусклая, морщинистая, шероховатая, зернистая и др.);

Прозрачность (прозрачная, непрозрачная, полупрозрачная);

Консистенция (маслянистая, тягучая, пленчатая, крошащаяся).

Для описания морфологических свойств из изолированных колоний готовят мазки, окрашивают по методу Грама и изучают под микроскопом. Следует обратить внимание на форму клеток, их взаимное расположение, наличие спор, капсул, результат окраски по Граму. При необходимости можно использовать и другие методы окраски микроорганизмов.

С целью дальнейшего исследования свойств микроорганизмов производят пересев в пробирки на скошенный МПА.

На основе исследованных свойств ориентировочно определяют род или вид выделенных культур микроорганизмов, используя «Краткий определитель бактерий Берги».

2. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

1. Внимательно осмотреть чашки и пробирки с посевами, отметить признаки роста на разных питательных средах.

3. Оценить качество продукта по микробиологическим показателям, сравнивая полученные данные с нормативами.

4. Изучить культуральные и морфологические признаки выделенных микроорганизмов и определить их род.

Контрольные вопросы

1. Дайте характеристику микробиологическим критериям безопасности пищевых продуктов.

2. Что такое КМАФАнМ? С какой целью определяют этот показатель и каким методом?

3. Что такое БГКП? С какой целью определяют этот показатель и каким методом?

4. Какие условно-патогенные микроорганизмы определяют в мясных продуктах?

5. Какие патогенные микроорганизмы определяют в мясных продуктах?

6. Как производится отбор образцов продуктов для исследования микрофлоры?

7. Как производится подготовка проб для исследования?

8. В каких документах содержатся микробиологические показатели пищевых продуктов?

Лабораторная работа № 3

Санитарно-микробиологический контроль

СПЕЦИАЛЬНЫЕ (ЭЛЕКТИВНЫЕ) ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Среды для выращивания дрожжей

Синтетическая среда Ридера

В состав среды входят, г/л: сульфат аммония 3, сульфат магния 0,7, нитрат кальция 0,04, хлорид натрия 0,5, дигидрофосфат калия 1,0, гидрофосфат калия 0,1. Начальный pH 6,6. В состав среды можно не вводить нитрат кальция, который дрожжами не используется. Для изучения размножения дрожжей добавляют 2% сахара, для исследования брожения - 5-10%. Полная синтетическая среда содержит кристаллические витамины, мкг/мл: инозит 5, биотин 0,0001, пантотеновая кислота 0,25, тиамин 1,0, пиридоксин 0,25, никотиновая кислота 0,5. Стерилизуют среду в автоклаве при давлении 0,1 М Па в течение 20 мин.

Глюкозоаммонийная среда

Содержит в 1 л водопроводной воды следующие вещества, г: сульфат аммония 5, дигидрофосфат калия 0,85, гидрофосфат калия 0,15, сульфат магния 0,5, хлорид натрия 0,1, хлорид кальция 0,1, глюкоза 20, агар 20. Для обогащения факторами роста добавляют дрожжевой (0,2%) или мясной (0,3%) экстракт и виноградный сок.

Синтетическая среда для выявления несовершенных дрожжей

Содержит в 1 л водопроводной воды следующие вещества, г/л: глюкоза 50, лизин 3, дигидрофосфат калия 1, сульфат магния 1, сульфат железа - следы. Каждый компонент растворяют в воде отдельно и добавляют в указанном порядке. В среду добавляют агар (1,5%), расплавляют, разливают по пробиркам и стерилизуют 20 мин при давлении 0,05 МПа.

Полная среда с лизином для выявления несовершенных дрожжей

Содержит в 1 л водопроводной воды следующие вещества, г/л: глюкоза 50, сульфат магния 1, дигидрофосфат калия 2, лактат калия 12 мл (50%-й раствор), /,(+) моногидрат лизина 1, витаминный раствор (на 100 мл стерильной дистиллированной воды добавляют, г: инозитола 2, пантотената кальция 0,4, никотинамида 0,5, гидраттиамина 0,1, агар 20; pH среды - 5-5,2. Среду разливают в пробирки по 15 мл и стерилизуют 15 мин при давлении 0,1 МПа.

Среда с ацетатом для обнаружения несовершенных дрожжей

На 1 л водопроводной воды берут 10 г ацетата натрия, 10 г хлорида аммония, 5 г глюкозы, 3 мл дрожжевого автолизата, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

Среда для выявления посторонних дрожжей, морфологически схожих с основной культурой

10 г пептона, 2 г гидрофосфата калия растворяют в 500 мл дистиллированной воды, фильтруют. В фильтрате расплавляют 15 г агара, добавляют 10 г глюкозы, 0,4 г эозина и 0,065 мл метиленового синего (90%-го спиртового раствора), доводят до 1000 мл горячей дистиллированной водой, разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при давлении 0,1 МПа. При стерилизации цвет исчезает, при охлаждении снова появляется. Хранят среду не более 2 мес.

Среда для образования псевдомицелия

Глюкозопептонный агар. К 1 л водопроводной воды добавляют, г: пептон 10, глюкоза 20, агар 30-35. Стерилизуют 30 мин при давлении 0,05 МПа. При необходимости можно добавить дрожжевой или мясной экстракт (0,5%) или готовить в жидком виде.

Картофельный агар. 100 г очищенного, вымытого, тонко нарезанного картофеля настаивают в прохладном месте несколько часов с 300 мл водопроводной воды. Вытяжку фильтруют, 230 мл вытяжки доводят водопроводной водой до 1 л, добавляют 20 г глюкозы, 30-35 г агара, расплавляют и стерилизуют 1 ч при давлении 0,075 МПа.

Дрожжевая вода с углеводами («цветной ряд»)

Способность дрожжей вызывать брожение углеводов определяют на дрожжевой воде с 2% исследуемого сахара (глюкоза, мальтоза, сахароза, лактоза, раффиноза и др.). Среду разливают в пробирки с поплавками, трубки Дунбара и стерилизуют дробно текучим паром. Учет результатов после засева ведут через 2 сут, при необходимости через 7 сут выращивания при температуре 30 °С.

Способность дрожжей усваивать углеводы путем окисления исследуют на среде следующего состава, r/л: сульфат аммония 5, дигидрофосфат калия 1, сульфат магния 0,5, автолитат 1, исследуемый сахар 10, агар 20. Среду разливают по пробиркам, стерилизуют 30 мин при давлении 0,05 МПа, приготавливают скошенный агар. Рост культур оценивают через 3-4 сут.

Дрожжевой агар с сахаром

В дрожжевой воде растворяют 0,5% хлорида натрия, 1% глюкозы (либо 4 или 10% сахарозы) и 2% агара, pH 6,8 (с глюкозой) и 6-6,5 (с сахарозой). Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

Среды с антибиотиками

Для преимущественного развития дрожжей и подавления сопутствующих бактерий в среды вводят антибиотики широкого спектра действия: стрептомицин (100 ед/мл), пенициллин (20-100 ед/мл), левомицитин (50 мг/л), неомицин (20 ед/мл) и др. Их можно добавлять в среду как вместе, так и по отдельности.

Среды для аскоспорообразования

Среда Городковой. Содержит в 1 л водопроводной воды, г: пептон 10, хлорид натрия 5, глюкоза 1 (или 2,5), агар 20; pH среды 7,3. Разливают по пробиркам и стерилизуют 15 мин при давлении 0,1 МПа.

Ацетатный агар Мак-Клари. К 1 л дистиллированной воды добавляют, г: ацетат натрия 8,2, хлорид калия 1,8, глюкоза 1, дрожжевой экстракт 2,5, агар 15. Автоклавируют 15 мин при давлении 0,1 МПа.

Среда Старки. В 1 л водопроводной воды растворяют, г: гидрофосфат калия 1, дигидрофосфат калия 0,25, сульфат магния 0,25, хлорид кальция 0,05, агар 20. Стерилизуют при давлении 0,05 МПа 15 мин.

Среда для выращивания осмофильных дрожжей

На 1 л глюкозного сиропа (50-60% СВ) добавляют 5 г пептона и 20 г агара. Пептон можно заменить дрожжевой водой (50 мл). Стерилизуют при давлении 0,05 МПа.

Мелассное сусло

200-300 г густой мелассы смешивают с водой в соотношении 1: 3, нагревают до температуры 95 °С и дают отстояться в течение 2 ч. При этом оседают коагулировавшие коллоиды и мелассный раствор осветляется. К раствору добавляют 3% диаммонийфосфата, разбавляют водой до 5-8% СВ и разливают в пробирки или колбы. Для приготовления агаризованной среды добавляют 1,5-2% агара. Стерилизуют при давлении 0,05 МПа 30 мин в автоклаве или дробно 1 ч с интервалом 20-24 ч 3 раза.

Среды для выращивания мицелиальных грибов

Свекловичный агар

Хорошо вымытую сахарную свеклу нарезают ломтиками, заливают водопроводной водой (20 г свеклы на 1 л воды) и кипятят в течение 30 мин. Фильтрат доводят водой до первоначального объема, прибавляют 2% агара и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 30 мин.

Свекловичная мезга

Чистую свеклу измельчают на терке, раскладывают в чашки Петри и, не переворачивая, стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 30 мин.

Среда Чапека

Состав среды, г/л: сахароза или глюкоза 30, дигидрофосфат калия 1,0, нитрат натрия 2,0, сульфат магния 0,5, хлорид калия 0,05, сульфат железа 0,1, агар 20. Навеску агара выщелачивают и добавляют к указанным ингредиентам, предварительно растворенным в 1 л дистиллированной воды, прогревают текучим паром, устанавливают pH 4,0-5,5 10%-м раствором лимонной кислоты или гидроксида натрия. Фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют дробно текучим паром 3 раза по 30 мин с интервалом 1 сут.

Сахаронитратный агар Чапека-Докса

Вариант 1. На 1 л дистиллированной воды берут, г: сахарозы 20, гидрофосфата калия 0,5, сульфата магния 0,5, хлорида натрия 0,5, нитрата калия 1, сульфата железа - следы, карбоната кальция 2-5, агара 20.

Вариант 2. На 1 л дистиллированной воды берут, г/л: сахароза 30, нитрат аммония 2,5, дигидрофосфат калия 1, сульфат магния 1, сульфат железа 0,01, агар 20.

Глюкозокрахмальная среда

Те же солевые компоненты, что и в сахарозонитратном агаре Чапека, но вместо сахарозы берут 25 г растворимого крахмала и 5 г глюкозы.

Крахмалоаммиачный агар

Состав среды, г/л: растворимый крахмал 10, карбонат кальция 3, гидро- фосфат калия 1, сульфат магния 1, хлорид натрия 1, сульфат аммония 1, агар 20. Стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,05 МПа.

Среда Сабуро

К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют, г: пептон 5, глюкоза 4, агар 1,8-2. Стерилизуют в течение 20 мин при давлении 0,05 МПа или дробно.

Основой этой среды служит дрожжевая вода. Для приготовления дрожжевой воды 70-100 г свежих прессованных дрожжей (7-10 г сухих дрожжей) кипятят в течение 20-30 мин в 1 л дистиллированной воды и отстаивают в высоком цилиндре на холоде в течение 12 ч. Отстоявшуюся жидкость декантируют, добавляют еще 1 л воды, кипятят 30 мин, фильтруют, доводят pH до требуемого значения. Приготовленную среду стерилизуют дробно по 20 мин 2-3 с интервалом 1 сут. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 2% агара, после растворения агара вносят 4% глюкозы или мальтозы, фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 20 мин.

Среду можно готовить и на обычной 1%-й пептонной воде.

Среды для выращивания молочнокислых бактерий

Гидролизованное молоко (по Богданову)

Обычное или обезжиренное (обрат) молоко (pH 7,6-7,8) кипятят в течение 5 мин, сосуд тщательно встряхивают и охлаждают до температуры 45 °С и на 1 л добавляют 0,5-1 г панкреатина, через 4-7 мин добавляют 5 мл хлороформа. Помещают в термостат на 18-20 ч при температуре 40 °С. Порошок панкреатина следует предварительно развести в небольшом количестве теплой воды. В течение первых часов молоко несколько раз перемешивают при открытой пробке. Гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр, разводят в 2-3 раза водой, устанавливают pH 7,0-7,2 и стерилизуют в течение 15 мин при давлении 0,1 МПа или в течение 20 мин при давлении 0,05 МПа.

Агар с гидролизованным молоком

В гидролизованное молоко вносят 1,5-2,0% агара. Смесь нагревают до кипения и выдерживают до полного растворения агара. Горячую среду фильтруют через ватный фильтр, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 10-15 мин.

Обезжиренное молоко с индикатором

Свежее, нагретое до кипения обезжиренное молоко подкрашивают в горячем состоянии лакмусовой настойкой до интенсивного сиреневого цвета. Стерилизуют текучим паром (3 раза по 30 мин с интервалом 1 сут) или автоклавированием в течение 10 мин при давлении 0,1 МПа.

Солодовое сусло с дробиной

Приготовляют солодовое сусло, но без отделения дробины (12-15% СВ). Разливают в пробирки, вносят стерильный мел (2-4%) и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

Дрожжевой агар с сахарозой

Для выявления Lactobacillus и Leuconostoc используют среду, приготовленную на основе дрожжевой воды с добавлением 0,5% хлорида натрия, 10% сахарозы и 2% агара; pH среды 6-6,5.

Ростковая среда

25 г солодовых (ячменных) ростков кипятят в течение 10 мин с 500 мл воды и после остывания до температуры 45-50 °С фильтруют через полотняный мешочек, осветляют взбитым куриным белком, вновь кипятят и фильтруют через бумажный фильтр для удаления свернувшегося белка. К раствору добавляют 1,5% пептона, 2% сахара, 2% агара и стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,05 МПа.

Капустная среда

200 г измельченной белокочанной капусты заливают 1 л воды, кипятят в течение 10 мин, отжимают через два слоя марли. Полученною жидкость фильтруют через складчатый фильтр, разводят в 2 раза и к отвару добавляют 2% глюкозы и 1% пептона, Разливают в пробирки и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 15 мин. Для получения плотной среды добавляют 2% агара.

Среда МРС (среда де Мана)

В состав среды входят, г/л: сульфат марганца 0,05, сульфат магния 0,2, гидрофосфат калия 2, нитрат аммония 2, ацетат натрия 5, пептон 10, дрожжевой экстракт Дифко 5, мясной экстракт 10, глюкоза 20, твин-80 1мл, pH среды 6-6,5. Среду фильтруют и стерилизуют дробно по 30 мин 3 раза с интервалом 1 сут или в автоклаве при давлении 0,05 МПа в течение 20 мин. Применяют в жидком, полужидком и агаризованном виде для родов Leuconostoc и Lactobacillus.

Среды МРС (в модификации А.А. Ланциера)

Среда МРС-1. В 200 мл дистиллированной воды растворяют, г: сульфат марганца 0,05, сульфат магния 0,2, цистеин 0,2, гидрофосфат калия 2, цитрат аммония 2, ацетат натрия 5, глюкоза 20, пептон 10, твин-80 1 мл (растворяют отдельно в небольшом количестве горячей дистиллированной воды), дрожжевой автолизат (см. Приложение 2) 50 мл, печеночный экстракт 100 мл. Объем жидкости доводят дистиллированной водой до 500 мл и добавляют 500 мл гидролизованного обезжиренного молока Богданова, предварительно не стерилизованного, pH 6,2-6,8. Среду фильтруют и стерилизуют дробно текучим паром.

Среда МРС-2. Предназначена для музейного хранения штаммов Lactobacillus. Готовят на основе среды МРС-1 с добавлением 0,15% агара. Получается полужидкая среда, создающая более анаэробные условия по сравнению с жидкой.

Среда МРС-3. Предназначена для «пестрого ряда» при идентификации молочнокислых бактерий. Основу ее составляет среда МРС-1, но без глюкозы, печеночного экстракта и гидролизованного молока. Углеводы и многоатомные спирты добавляют в количестве 0,5%. Количество вносимого агара - 0,15%. pH среды 7,0. Индикатором служит хлорфеноловый красный (0,004%). Индикатор растворяют в 1-2 мл этилового спирта и прибавляют к среде перед стерилизацией. Хлорфеноловый красный дает переход окраски среды от красно-фиолетового к желтому в пределах pH 4,8-6,4.

Печеночный экстракт

Свежую говяжью печень мелко разрезают и заливают водой (на 1 кг печени 1 л воды). Кипятят в течение 30 мин и фильтруют, после чего стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 20 мин.

Среда 10

На 1 л неохмеленного пивного сусла (8% СВ) или 1 л дрожжевой воды добавляют, г: сульфат марганца 0,05, сульфат магния 0,2, цистин или цистеин 0,2, гидрофосфат калия 2, цитрат аммония 0,2, ацетат натрия 2,5, сахароза 20, пептон 10, дрожжевой автолизат 50 мл. Каждый компонент растворяют в указанном порядке в солодовом сусле (для Lactobacillus) или дрожжевой воде (для Leuconostoc). В первом случае pH среды 5,5, во втором - 6,0. Добавляют 1,5% агара и стерилизуют текучим паром. В чашки Петри можно добавить стерильный мел.

В 150 мл профильтрованного томатного сока растворяют при подогревании 0,75 мл твин-80 и 37,5 г глюкозы, прибавляют 5 мл дрожжевого автолизата, 600 мл обезжиренного молока (обрата) и 150 мл расплавленного 2%-го мясопептонного агара. pH устанавливают равным 7,0. Среду разливают в пробирки по 6-7 мл, стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 20 мин, охлаждают, засевают исследуемыми молочнокислыми бактериями и сверху наслаивают 1-2 мл расплавленного 2%-го мясопептонного агара. В случае слабого газообразования пробка отделяется от основной среды, при сильном газообразовании поднимается высоко или вылетает из пробирки.

Среды для выращивания слизеобразующих бактерий

Вариант 1. Мясопетонный агар с 10% сахарозы.

Вариант 2. Состав, г/л: сахар-сырец 40, гидрофосфат натрия 2, хлорид натрия 0,5, сульфат магния 0,1, сульфат железа 0,01, карбонат кальция 10, агар 20.

Среда Виттенбари

В состав среды входят, г/л: мясной экстракт 5, пептон 5, дрожжевой автолизат 50 (или дрожжевой экстракт 50), 1,6%-й раствор бромкрезолового пурпурного 1,4 мл, pH 6,8-7,0. Стерилизуют текучим паром 3 раза по 45 мин с интервалом 1 сут.

Среды для выращивания гнилостных аспорогенных бактерий

Молочный агар

Обезжиренное молоко разливают по 5 мл в пробирки и стерилизуют текучим паром или в автоклаве в течение 20 мин при давлении 0,05 МПа. Отдельно готовят 3%-й водный агар, разливают по 4-5 мл в пробирки и стерилизуют в течение 30 мин при давлении 0,1 МПа. Агар расплавляют, стерильно соединяют с молоком и заливают в чашки Петри, куда предварительно внесена исследуемая проба.

Среды для выращивания жирорасщепляющих бактерий

Вариант I. К 1 л воды добавляют 5 г пептона и 3 мл дрожжевого автолизата. Установив pH 7,2-7,4, добавляют 1,5% агара. Агар расплавляют, среду фильтруют и добавляют 1% горячего молочного жира или оливкового масла. Перемешивают, разливают по пробиркам и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 15 мин.

Вариант 2. К мясопептонному агару добавляют 2-4% молочного жира или оливкового масла. Разливают по 10 мл в пробирки и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 20 мин. Перед внесением в чашки среду тщательно встряхивают.

Примером такой среды может служить желатина с гидролизованным молоком. К гидролизованному молоку (можно использовать гидролизо- ванный казеин или мясопептонный бульон) добавляют 10% желатины, дают ей набухнуть и нагревают при помешивании до температуры 50 °С. pH среды 7,0-7,2. Среду фильтруют и стерилизуют в пробирках при давлении 0,075 МПа в течение 20 мин.

Среды для выращивания уксуснокислых бактерий

К солодовому суслу или капустной среде добавляют 4 об. % этилового спирта и 20 ед/мл антибиотика мономицина, подавляющего рост молочнокислых бактерий.

Среды для выращивания анаэробов

Среда Виноградского. В 1 л дистиллированной воды растворяют, г: гидрофосфат калия 1, сульфат магния 0,5, сульфат марганца 20, глюкоза 20, хлорид натрия и хлорид железа - следы.

Среда Кита-Тароцци. Проваренные и промытые водой кусочки печени или мяса опускают в пробирку, чтобы они покрывали дно. Наливают мясопептонный бульон с 1% глюкозы (pH 7,2-7,4) на "/ 2 объема пробирки и опускают поплавок. Сверху наливают слой вазелинового масла высотой 1 см. Стерилизуют по 15 мин при давлении 0,1 МПа 2 раза с интервалом 30 мин.

Среда для выращивания термофильных анаэробов, образующих сероводород

В состав среды входят, г/л: пептон 10, сульфат железа 1, агар 20. Перед розливом в каждую пробирку помещают чистый железный гвоздь. После засева сахара в пробирку наливают слой стерильного вазелинового масла. При наличии в сахаре сероводородообразующих бактерий в агаре образуются характерные черные колонии.